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就在光緒死去的第二天下午，他的母后及政敵、操縱晚清政權達半個世紀之久的慈禧太后也死在中南海儀鸞殿內，終年七十四歲。
光緒皇帝和慈禧太后先後去世的消息傳出，中外同感震驚。人們普遍認為，年紀輕輕的光緒反而死在七十四歲的慈禧前面，而且只差一天，這不是巧合，而是處心積慮的謀害。於是，光緒被人謀害致死的種種說法便由此而產生。
晚清御史、光緒的近臣惲毓鼎的《崇陵傳信錄》及徐珂所編著的《清稗類鈔》等書認為，慈禧在病危期間，惟恐自己死後，光緒重新執政，推翻她既定朝政及平反她一手製造的種種冤案，於是令人下毒手將光緒害死。
英國人濮蘭德?白克好司的《慈禧外傳》和德齡的《瀛台泣血記》等書認為，清宮大太監李連英等人，平日依仗著主子慈禧的權勢，經常中傷和愚弄光緒。他們深恐慈禧死後光緒重新主政，會清算他們往日的罪孽，所以就先下手為強，在慈禧將死之前，先把光緒謀斃。
溥儀在《我的前半生》一書中談到，袁世凱在戊戌變法時辜負了光緒的信任，在關鍵時刻出賣了皇上。袁世凱擔心一旦慈禧死去，光緒決不會輕饒了他，所以就借進藥的機會，暗中下毒，將光緒毒死。
曾經是清宮御醫的屈貴庭在《逸經》雜誌二十九期上發表一篇文章說，在光緒臨死的前三天，他最後一次進宮為皇上看病，發現光緒本已逐漸好轉的病情卻突然惡化，在床上亂滾，大叫肚子疼。沒過幾天，光緒便死了。這位御醫認為，雖不能斷定是誰害死了光緒，但卻可以肯定光緒是被人暗中害死的。
但也有不少史籍或接近宮禁者對光緒之死持自然病死之說。如《德宗實錄》、《光緒朝東華錄》、《清史稿?德宗本紀二》等所謂正史或官修史籍內，均載光緒系正常死亡；再如《萇楚齋三筆》卷六則稱：早在光緒三十四年二三月間，光緒帝久病未愈，早入膏肓，是時肝氣大發，以手扭太監頂戴，以足踢翻電燈，情勢日及。又光緒臨終前一段時間，一直為其治病的六位名醫之一杜鍾駿所著《崇德請脈記》一書，對光緒之病情、診病經過以及光緒臨終前的病狀，敘述頗詳，證明光緒確實是正常死亡。
由於上述種種傳聞，使光緒之死成為清末歷史上一大疑案，眾說紛紜。關於光緒之死這一疑案無論當時或在日後，雖有種種傳說，但因事涉清代宮禁秘檔，人們無從知其真實內幕，均缺乏真實可靠的依據。那麼，光緒究竟是怎麼死的？讓我們且從太醫院御醫和皇宮醫案（也稱“脈案”）談起。
在中國歷代封建王朝的宮苑中，都設置有專門為皇帝、皇后、妃、嬪、王公大臣等診治疾病、調養身體的太醫院。在這裡，集中了祖國傳統醫學中的國醫高手，備藏了從全國各地搜集到的珍奇名貴藥材。太醫院有著上千年的歷史，積累了許多既穩妥又有一定療效的處方，以及許多寶貴的臨床醫療經驗，是祖國傳統醫學的精英薈萃之地。然而，皇宮醫學卻歷來被深鎖宮禁，秘而不宣；究竟皇帝及其後、妃等怎樣看病，御醫又如何為他們把脈治病、施藥護理，等等，一向令人神秘莫測。
清太醫院沿襲明制，其官署最初設在正陽門內東交民巷內。光緒二十六年（１９００）八國聯軍入侵北京，清政府屈服西方列強的壓力，被迫與之簽訂不平等的喪權辱國《辛丑條約》。依據條約第七款，將這一地區劃為各國駐華使館區。太醫院只得另在地安門外建立新署，現在遺址尚存，但已是面目全非。太醫院在紫禁城內東牆下，上駟院之北，設有待診、休息的處所，舊稱“他坦”，歲月流失，現已傾毀無存。
清太醫院為五品衙門，其最高行政長官為院使。副職二人，稱為左院判、右院判，官居六品。太醫院有御醫十三人官居八品；醫士二十人、醫生三十人（皆沒有品級），享有從九品的待遇，統稱御醫。清初按醫科分為：大方脈、小方脈、婦人、瘡瘍、針灸、眼、口齒、接骨、傷寒、咽喉、豆疹十一科。光緒時期，合併為五科，即大方脈、小方脈、外科、眼科、口齒科。平日，有太醫院院使、院判及其屬員在宮中當班。每當皇帝駐蹕園庭，或出巡各地，太醫院御醫也隨之前往。
太醫院御醫在從事醫療活動中，皆建有詳細的病歷，即所謂“醫案”（又稱“脈案”）。在中國第一歷史檔案館保存有大量的清代皇宮醫案。其中包括皇帝、皇后、妃嬪、皇子、公主、太監、宮女以及王公大臣的原始診病記錄、內務府抄件、帝後用藥底簿、配方秘本、御藥房、御膳房和御茶房的各項記錄，以及皇帝及個別皇后的起居注、皇帝有關醫藥的硃批、宮中敬事房的檔案，等等。特別是乾隆以後諸帝及其後、妃等的脈案保存得較為完整，其中尤以光緒的脈案為最多。清代皇宮的醫案總數約有四萬件。在這些醫案史料中，其診治處方大都出自太醫院御醫之手。但也有少數非太醫院的官方處方，如施煥、呂用賓、陳秉鈞等地方名醫為光緒診病的處方，便是其例。這些人都是懂得醫道的大小官員，或在京城，接近宮廷，或在地方，而由地方總督、巡撫奉詔保舉來京入宮為光緒看病的。
二、記載光緒直接死因的秘檔
在清宮醫案中，既有當年御醫為光緒診病用藥的原始病歷，也有光緒本人口述或親書病史病狀的“病原”，尤其是光緒臨死前半年的“脈案”保存得相當完整。這些珍貴的原始記錄，應是解開光緒生前病狀及其死因的重要而可靠的直接依據。根據這些珍貴的診病原始記錄，中國第一歷史檔案館清史檔案專家會同中國中醫研究院醫學專家，對光緒病案進行了深入系統的研究。他們的研究成果對揭開光緒的死因提供了真實可靠的依據。